Вода — источник кислорода при фотосинтезе | Журнал Природа 7/1971 10.06.1971

В. М. Кутюрин Доктор биологических наук

Владимир Михайлович Кутюрин заведует лабораторией фотосинтеза в Институте геохимии и аналитической химии им. В. И. Вернадского АН СССР. Автор большого числа работ по фотосинтезу растений. В последние годы занимается исследованием механизма разложения воды растениями.

Биологи, физики и химики всего мира отмечают в 1971 г. 200-летие открытия Джозефом Пристли фотосинтеза растений. Исключительный интерес к фотосинтезу объясняется его огромным практическим и теоретическим значением.

Фотосинтез — основной процесс создания органических веществ на Земле, а следовательно, основа урожаев сельскохозяйственных культур. Проблема пищевых ресурсов в связи с ростом населения остро ставит вопрос о повышении фотосинтетической продуктивности растений. Но урожай сельскохозяйственных растений, составляющий приблизительно 2 млрд т органических веществ в год, не так уж велик по сравнению с сотнями миллиардов тонн органического вещества, создаваемого ежегодно всеми растениями Земли. Эта цифра указывает на масштабы основной кормовой базы всех гетеротрофных организмов.

Деятельность фотосинтезирующих организмов в течение миллиардов лет наложила большой отпечаток на геологическую и биологическую историю Земли. По словам В. И. Вернадского, фотосинтез «изменил лик Земли». Миллиарды тонн кислорода, ежегодно выделяемого растениями, привели в прошлом к созданию кислородной атмосферы и озонового экрана — решающих факторов для развития живых организмов и возникновения аэробного дыхания, преобладающего сейчас в живом мире.

Фотосинтез растений — это процесс превращения неорганических молекул воды, углекислого газа, азот- и серусодержащих молекул в органические вещества (углеводы, жиры, белки) с помощью энергии солнечного света (рис. 1). Световая энергия используется растениями на восстановление углекислого газа и разложение воды.

Решение проблемы фотосинтеза стало одной иэ основных задач современного естествознания. Многочисленные исследования, выполненные в последнее время в различных странах, привели к значительным успехам в изучении механизма фотосинтеза: выяснены в основных чертах процесс фиксации и восстановления углекислого газа, механизм сенсибилизирующего  действия хлорофилла и характер электрон-транспортной цепи хлоропластов. Но есть и другие важные еще недостаточно изученные проблемы, до недавнего времени остававшиеся белыми пятнами на карте исследований фотосинтеза. К их числу относится процесс разложения воды растениями. В настоящей статье мы остановимся на основных этапах изучения этого вопроса.

Долгое время среди физиологов растений господствовало представление, согласно которому кислород фотосинтеза выделяется в результате фоторазложения молекулы углекислого газа, т. е., иными словами, получается из углекислого газа. Основанием для таких представлений послужили опыты Т. Соссюра (1808, Швейцария), показавшие, что при отсутствии углекислого газа прекращается выделение кислорода. Правда, свыше ста лет спустя Р. Хилл (1937, Англия) наблюдал выделение кислорода хлоропластами растений, когда они восстанавливали искусственный акцептор электрона — соли железа. Но это не поколебало преобладающего мнения о фотосинтезе как о процессе специфического фотовосстановления углекислого газа до углеводов по уравнению:

Роль воды сводилась при этом к гидратации в темноте неизвестного специфического углеродного соединения, получающегося при разложении молекулы углекислого газа на свету.

Только в 1941 г. А. П. Виноградов и Р. В. Тейс показали, что кислород в ходе фотосинтеза образуется из воды, а не из углекислого газа. Это открытие было сделано после сопоставления изотопного состава кислорода, выделяемого растениями, с изотопным составом кислорода воды и углекислого газа. Выяснилось, что выделенный растениями кислород по своему изотопному составу ближе к тому, что содержится в воде ]. Одновременно к такому же выводу пришла группа американских исследователей во главе с проф. С. Рубеном, использовавшая в эксперименте меченные по 180 воду и карбонаты. Это открытие изменило весь последующий ход исследований фотосинтеза.

Водное происхождение кислород фотосинтеза указывало на то, что световая энергия расходуется на разложение воды. Такая возможность предсказывалась отечественными учеными еще в начале XIX в. (Ф. Гизе, А. Двигубский). Однако сам механизм разложения воды и выделения кислорода оставался долгое время неизученным. Видимо, поэтому вплоть до 60-х годов в литературе по фотосинтезу высказывались сомнения, что именно вода — источник атмосферного кислорода. Дело в том, что долгое время в различных опытах не удавалось получить совпадения между изотопным составом кислорода воды и кислорода, выделенного растениями. Казалась непонятной также причина расхождения в данных об изотопном составе кислорода у различных исследователей. Это обстоятельство давало повод для шуток о влиянии географической широты на результаты эксперимента.

В 1962 г. А. П. Виноградов и В. М. Кутюрин высказали предположение, что изотопный состав кислорода фотосинтеза тождествен изотопному составу кислорода воды, а наблюдающаяся между ними разница является следствием фракционирования, т. е. разделения изотопов кислорода растениями при его поглощении на свету. Вскоре это предположение было подтверждено экспериментально. Как показали специальные исследования, при поглощении кислорода растениями исходная изотопная смесь разделяется (фракционируется) благодаря большей скорости поглощения и восстановления легких изотопных молекул |60/|60 по сравнению с |60/180. В результате остающийся кислород утяжеляется, т. е. содержит больше тяжелых изотопных молекул. Степень утяжеления кислорода зависит от интенсивности его поглощения на свету растениями и от интенсивности процесса фракционирования.

Сказанное иллюстрируется рис. 2. В оптимальных условиях, когда интенсивность освещения достигает значения, при котором скорость фотосинтеза становится максимальной, фракционирования изотопов не происходит (рис. 3) и кислород, выделяемый растениями, соответствует кислороду фотосинтеза. В предшествующих работах освещение и культивирование растений не были оптимальными, поэтому растения фракционировали изотопы кислорода с различной интенсивностью, в зависимости от условий опыта.

Фракционирование изотопов кислорода наблюдается не только в растениях. Те же закономерности, которые лежат в основе этого явления на уровне клетки, присущи и разделению изотопов атмосферного кислорода, происходящему в грандиозных масштабах биосферы. С фракционированием, в частности, связан изотопный сдвиг между атмосферным кислородом и кислородом, выделяемым растениями, получивший название эффекта Дола. Основную роль в разделении изотопов атмосферного кислорода играет поглощение кислорода в Мировом океане (за" счет дыхания фитопланктона и бентоса, окисления органических веществ, растворенных в морской воде; А. П. Виноградов, 1962). Некоторые исследователи видели в эффекте Дола противоречие между водным происхождением кислорода фотосинтеза и фотосинтетическим образованием атмосферного кислорода. На самом деле оба эти случая являются следствием одной и той же причины— фракционирования изотопов кислорода в процессах его потребления.

Тождество изотопного состава кислорода фотосинтеза и кислорода воды показывает, что именно вода служит единственным источником фото- синтетического кислорода, так как все другие кислородсодержащие природные соединения имеют другой изотопный состав — кислород таких соединений тяжелее водного. Поэтому можно сказать, что вода является непосредственным субстратом окисления кислорода, т. е. тем веществом, которое окисляется с выделением молекулярного кислорода.

Все остальные формы — гидроксильный ион, фосфатная и карбонатная группы, которые оперировали в различных гипотезах по механизму выделения кислорода фотосинтеза, отпадают.

Итак, вопрос о происхождении кислорода фотосинтеза был решен. Возникла проблема—каков механизм окисления воды? Было лишь известно, что разложение воды происходит в хлоропластах и что какую-то роль в этом процессе играет хлорофилл. Можно представить себе два случая, характеризующих связь воды с центром окисления (рис. 4). В первом случае вода не связана прочно с центром X и свободно обменивается с внутриклеточной водой, которая в свою очередь обменивается с водой внешней среды. Если принять это предположение и ввести в питательную среду меченную по ,80 воду, то скорость поступления метки в кислород фотосинтеза будет равной поступлению ее во внутриклеточную воду. Во втором случае этого не должно произойти, так как вода прочно связана с комплексом хлоропластов, где происходит ее разложение, поэтому скорость поступления метки в кислород фотосинтеза будет отставать от темпов поступления ее во внутриклеточную воду.

Как показали наши опыты (В. М. Кутюрин, Н. М. Назаров, К. Г. Семенюк, 1966), так и происходит в действительности.

Молекула хлорофилла как истинного катализатора остается после поглощения световой энергии и завершения процесса сенсибилизации неизменной. Выяснение механизма сенсибилизирующего (или каталитического) действия хлорофилла, а также связи этого процесса с разложением воды является одной из основных задач проблемы фотосинтеза. Сейчас можно считать доказанным предположение К. А. Тимирязева (1871) о роли хлорофилла как химического сенсибилизатора. Мы уже видели (см. рис. 1), что одна молекула хлорофилла (Хл. ai) катализирует перенос электрона от цитохрома f к неизвестному акцептору X. При этом возбужденная молекула хлорофилла сначала передает свой электрон, поскольку обладает сильным восстановительным свойством (ее потенциал — 0,7 в). Окисленная форма хлорофилла — окислитель средней силы (ее потенциал +0,42 в) — забирает электрон от цитохрома. Что касается второй молекулы хлорофилла, то в большинстве последних схем фотосинтеза имелось в виду, что она не реагирует с водой непосредственно. Эту роль приписывали сопряженному с хлорофиллом окислителю Y неизвестной природы. Вывод об окислении воды неизвестным веществом возник в результате некоторого разочарования (правда, необоснованного) после ряда неудач при изучении вопроса о возможности переноса хлорофиллом атома водорода воды.

Идея о том, что хлорофилл переносит атом водорода воды, свыше 30 лет занимала умы исследователей. Поскольку хлорофилл обладает подвижными атомами водорода, то казалось, что они могут принимать участие в передаче хлорофиллом водорода от воды. Предполагалось, что хлорофилл вначале отдает свой водород, а затем забирает его от воды.

Однако исследования показали, что такой обмен, идущий с заметной скоростью в модельных системах, в природных условиях, в растениях, не происходит. Поскольку любой механизм разложения воды приводится в действие только энергией света, поглощаемой хлорофиллом, оставался один возможный вариант решения вопроса — перенос электрона от воды хлорофиллом.

Возник вопрос, может ли сам хлорофилл непосредственно реагировать с водой? В этом случае необходимо, чтобы соответствующее вещество имело сродство к воде, а его окислительный потенциал составлял бы Е,з' Je: И- 0,81 в при pH 7. О сродстве хлорофилла к воде было известно еще иэ классических работ Вильштеттера и Штоля. Что же касается окислительно-восстановительного потенциала окисленной формы хлорофилла (точнее, системы Хл.+ / Хл.), этот вопрос оставался открытым. Единственная форма хлорофилла в растениях, для которой удалось замерить потенциал окисленного состояния in vivo,—это форма с максимумом поглощения света 700 нм. Она фигурирует в качестве формы Хл. в] на рис. 1. Кроме нее в растениях присутствует еще несколько форм, в отдельных случаях удается определить 6—8 форм хлорофилла «а», которые отличаются друг от друга по максимуму поглощения света: 670, 680, 720 нм и т. д. Различие между этими формами заключается не в строении хлорофилла, а в способе упаковки молекул в так называемые ассоциаты и в различной связи с молекулами белков и липоидов в хлоропластах.

В последнее время расширяется фронт работ по выделению из растений хлорофилл-белковых комплексов, но они еще недостаточно изучены и их окислительно-восстановительный потенциал неизвестен. Трудность заключается в том, что время «жизни» окисленной формы хлорофилла в растениях очень мало: от секунды, и то в специальных условиях, до 10_3 сек. и меньше. Поэтому пришлось обратиться к изучению окислительно - восстановительных свойств хлорофиллов в растворах, где их время жизни исчисляется секундами.

Исследования в нашей лаборатории показали, что хлорофилл обладает двумя центрами окисления и осуществляет перенос двух электронов по схеме:

Указанные значения потенциала реализуются только в липофильных растворителях (ацетон, ацетонитрил и т. п.), когда концентрация воды не превышает 2% по объему и окисленная форма хлорофилла может окислить воду.

Окисление воды растениями обладает очень важной специфической чертой: практически все кванты света, поглощаемые хлорофиллом (и преобразуемые формой Хл. а2), вызывают окисление воды с выделением кислорода. Это значит, не происходит обратных реакций, которые могли бы снизить эффективность процесса разложения воды. В то же время при окислении воды должен образоваться гидроксильный радикале Н20 —* Н20+ -и Н+ + ОН', который известен как сильный окислитель и обладает высокой реакционной способностью. Поэтому в механизме окисления воды для предотвращения обратных реакций должен существовать способ отделения гидроксильного радикала от восстанавливаемого вещества (хлорофилла).

Как показали исследования, взаимодействие между хлорофиллом и водой осуществляется по карбоциклическому кольцу (рис. 5). Нам кажется вероятным, что пространственное разделение гидроксильного радикала и молекулы хлорофилла начинается на молекулярном уровне. Возбужденная форма хлорофилла, возникшая после поглощения им кванта света, отдает свой электрон непосредственному партнеру по электрон-транспортной цепи хлоропластов— молекуле Q++ (см, рис. 1).

Окисленная форма хлорофилла забирает электрон oт атома кислорода воды, связанной с карбоциклическим кольцом Y. Это осуществляется благодаря тому, что замкнутая электронная конфигурация сопряженной системы двойных связей хлорофилла, отмеченная жирной линией на рис. 5, в окисленном состоянии разрывается и замыкается на карбоциклическое кольцо. После того как хлорофилл забрал электрон от кислорода воды, вновь возникает замкнутая электронная конфигурация, препятствующая обратной реакции между хлорофиллом и окисленной молекулой воды.

Итак, мы полагаем, что окисление воды при фотосинтезе осуществляется непосредственно окисленной формой хлорофилла и что в строении самой молекулы хлорофилла и в ее свойстве образовывать связь с водой по карбоциклическому кольцу заключается секрет осуществления первого этапа механизма разложения воды — окисления атома кислорода воды — с максимальной эффективностью.

Помимо окисления воды, растения осуществляют с той же эффективностью и дальнейшую последовательность реакций, приводящих к выделению кислорода фотосинтеза. Механизм образования кислорода фотосинтеза нам еще мало известен, но теоретически возможны лишь два варианта формирования кислорода: В первом варианте молекула кислорода формируется в результате окисления четырех молекул воды, Каждый атом кислорода воды окисляется только один раз и образующиеся четыре гидроксильных радикала реагируют между собой. В результате этого два из них восстанавливаются до воды, а два оставшихся окисляются до молекулярного кислорода. Этот механизм известен для растворов гидроксильных радикалов в чистой воде (И. А. Казарновский и др., 1958).

Во втором варианте молекула кислорода формируется при окислении двух молекул воды. Каждый из двух гидроксильных радикалов должен быть окислен еще раз, чтобы образовать два атома кислорода. Такой механизм напоминает процесс формирования кислорода при электролизе щелочных растворов на металлах переменной валентности (А. И. Красильщиков, 1963).

До сих пор мы почти ничего не говорили о металлах переменной валентности, входящих в состав хлоропластов, о их роли в механизме разложения воды. Между тем, этот вопрос представляет существенный интерес. В процессе фотосинтеза формирование кислорода происходит в среде органических веществ, а известно, что гидроксильный радикал обладает высоким окислительным потенциалом (Ео = 1,6в при pH 7) и чрезвычайно быстро реагирует с углеводородами, спиртами, цитохромами, альдегидами и ионами металлов.

Время жизни гидроксильного радикала в среде с указанными веществами порядка 10-8 -г- 10-10 сек. В то же время из опытов Жолио (1967— 1969; Франция) известно, что механизм выделения кислорода срабатывает за время порядка 10~3 сек., т. е. по крайней мере в сто тысяч раз большее, чем время существования гидроксильного радикала. Значит, должен существовать способ задержки, консервирования гидроксильных радикалов в растениях при фотосинтезе. Простейшим, казалось бы, мог быть способ димеризации гидроксильных радикалов с образованием перекиси водорода по уравнению 2’ОН —► Н2О2, тем более, что все растительные клетки имеют специальный фермент каталазу, содержащий железо для разложения перекиси водорода с выделением кислорода. Однако еще раньше было известно, что каталазная активность хлоропластов и скорость выделения кислорода не коррелируют между собой. Недавно в нашей лаборатории было показано, что при полном подавлении каталазной активности скорость выделения кислорода хлоропластами не изменяется (М. В. Улубекова и др., 1968). Следовательно, димеризации не происходит и наиболее вероятным, на наш взгляд, может быть превращение гидроксильного радикала в гидроксильную группу; связанную с атомом металла переменной валентности. Вода может разлагаться в результате участия этого металла. Таким металлом по всей вероятности является марганец.

Исследования, проведенные в нашей лаборатории, показали, что в механизме выделения кислорода играет роль та часть марганца, которая связана со структурой хлоропласта. Было известно, что дробление хлорспластов с помощью поверхностно-активных веществ ведет к образованию фрагментов, которые не выделяют кислорода. Вместе с тем фрагменты такого же размера, но полученные с помощью ультразвука, обладают этой способностью: они содержат больше марганца (рис. 6). Следовательно, марганец и определенная структура хлоропластов необходимы для функционирования механизма разложения воды с выделением молекулярного кислорода.

Нам кажется вероятным гипотетический механизм разложения воды, показанный на рис. 7. В первом варианте приведена кооперация четырех одинаковых реакционных центров, осуществляющих разложение четырех молекул воды с образованием промежуточных гидроксильных радикалов. Чтобы выразить это в виде пространственной схемы, на рисунке опущены детали механизма каждой отдельной стадии (они, кстати, указаны на рис. 5). Важно подчеркнуть, что для эффективного осуществления процесса разложения воды необходимо, во-первых, пространственное сопряжение фотохимических центров с каталитической системой, выделяющей кислород, а во- вторых — быстрый отток электронов от акцептора Q.

Если растения осуществляют разложение воды и выделение кислорода по второму пути (см. схему на стр. 29), то повторное окисление гидроксильной группы, связанной с атомом металла, требует сопряжения второй стадии окисления атома кислорода воды с другой формой хлорофилла, т. е. в этом случае в механизме разложения воды должны принимать участие две различные формы хлорофилла. Обычно говорят об участии в механизме разложения воды только одной формы хлорофилла, с максимумом поглощения 670 нм, так как с ростом длины волны за 680 нм интенсивность фотосинтеза падает, хотя растения еще поглощают свет до 800 нм (рис. 8).

Создавалось впечатление, что раз. ложение воды связано только с формой 670. На самом деле все оказалось иначе.

В анаэробных условиях, т. е. когда содержание кислорода исчезающе мало, растения, как выяснилось, способны выделять кислород и в области, большей 700 нм. Механизм выделения кислорода в данном случае отличен от обычного, когда растения освещаются белым или монохроматическим светом, но с длиной волны до 700 нм. Этот механизм ингибируется кислородом и фотосинтетиче- скими ядами, причем можно подобрать условия, когда выделение кислорода, например в области 718 нм, полностью подавляется, а на белом свету или при освещении с 7. — 690 нм он выделяется с неизменной скоростью. Параллельное наблюдение за скоростью восстановления углекислого газа с помощью радиоактивного изотопа МС показало, что ингибирование скорости выделения кислорода в длинноволновой области спектра прекращает также процесс восстановления углекислого газа. Следовательно, в этой области спектра существует свой особый механизм разложения воды. Таким образом, в поисках второй формы хлорофилла, участвующей в разложении воды, мы обнаружили существование второго механизма разложения воды (В. М. Кутюрин и др., 1968; В. М. Кутюрин, М. В. Улубекова, 1971).

Обе схемы разложения воды (см. рис. 7) позволяют объяснить известные нам основные закономерности выделения кислорода растениями. Дальнейшие исследования покажут, насколько эти схемы соответствуют действительности и, возможно, внесут в них необходимые коррективы.

Оценивая в целом имеющиеся данные, можно сказать, что механизм разложения воды растениями является уникальным примером биологического окисления как по своим масштабам, так и по эффективности действия. Конечно, функционирование такого механизма стало возможным в результате длительной эволюции фотосинтетического аппарата растений. Жизнь, возникшая в Мировом океане, протекала сначала в условиях без свободного кислорода, когда преобладала восстановительная среда с готовыми органическими соединениями. Исчерпание их запасов привело к возникновению автотрофных организмов — фотосинтезирующих бактерий, окисленная форма пигмента которых еще не могла окислить воду. Только с появлением хлорофиллсодержащих растений стало возможным использование воды в качестве восстановительного субстрата.

Есть основания полагать, что оптические свойства атмосферы того времени обусловили преобладание длинноволновых лучей в солнечном свете, достигавшем поверхности Земли. Поэтому бактериальные пигменты имеют максимум поглощения в длинноволновой области спектра (от 865 до 985 нм), видимо, и активные формы хлорофилла были первоначально длинноволновыми. Обнаруженный нами механизм разложения воды в длинноволновой области спектра мог быть эволюционно более ранним. Его функционирование в отсутствие кислорода происходит и сейчас. Такой вывод находит свое подтверждение в существовании реликтовых черт в строении оптического аппарата существующих ныне растений, Дальнейшее изменение условий и вызванная этим эволюция привели к механизму с доминированием коротковолновой формы хлорофилла 670, в котором не исключено участие других форм пигмента.

Вода, послужившая колыбелью жизни, превратилась благодаря фотосинтезирующим организмам в основное сырье для разнообразного синтеза органических веществ, служащего и сейчас материальной основой существования гетеротрофных организмов.

10 июня 1971 года.

содержание

Отзывы о статье (0) / +добавить